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Next Generation Sequencing in der Pathologie

Anwendungen und methodische Herausforderungen

Next generation sequencing in histopathology

Applications and methodological challenges

  • Schwerpunkt: Prädiktive molekulare Pathologie für die gezielte Tumortherapie
  • Published:
Der Pathologe Aims and scope Submit manuscript

Zusammenfassung

Die enorme Beschleunigung der DNA-Sequenzierung durch die Entwicklung der Next-Generation-Sequencing-Technologien eröffnet dem Fach Pathologie nicht nur völlig neue Möglichkeiten in Forschung und Diagnostik, sondern stellt es auch vor große Herausforderungen.

Der Nachweis zahlreicher genomischer Alterationen (Punktmutationen, kleine Insertionen und Deletionen, Fusionstranskripte, Tumormutationslast [TMB]) wird bereits zuverlässig in der molekularpathologischen Routinediagnostik eingesetzt. Diese werden in absehbarer Zeit durch zahlreiche weitere Anwendungen (Genamplifikationen, Mikrosatelliteninstabilität, genomische Signaturen wie homologe Rekombinationsdefizienz (HRD), mRNA-Profile, B‑ und T‑Zellklonalität, DNA-Methylierung) ergänzt werden.

Herausforderungen in der Präanalytik, der Beurteilung der Assaysensitivität und -spezifität sowie der Bewertung der identifizierten Aberrationen (Variantenbewertung), die die Ausbildung und den Einsatz neuer Fachkräfte erfordern, werden dargestellt und diskutiert.

Abstract

The enormous increase in sequencing capacity due to the development of next generation sequencing technologies opens up new opportunities in the fields of histopathology, research, and diagnostics, but also poses huge challenges.

The identification of genomic aberrations (point mutations, small insertions and deletions, fusion transcripts, and tumor mutation burden (TMB)) have already become a reliable part of routine molecular diagnostics. This will be supplemented by additional applications, namely gene amplifications, microsatellite instability, genomic signatures like homologous recombination deficiency (HRD), mRNA expression patterns, B‑ and T‑cell clonality, and DNA methylation. Challenges in preanalytics and the evaluation of assay sensitivity and specificity as well as proper curation of identified aberrations, which requires a new type of specialist, are presented and discussed.

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Abb. 1

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Author information

Authors and Affiliations

  1. Institut für Pathologie, Medizinische Hochschule Hannover, Carl-Neuberg-Str. 1, 30625, Hannover, Deutschland

    Ulrich Lehmann

  2. Pathologisches Institut, Medizinische Fakultät, LMU München, Thalkirchner Str. 36, 80337, München, Deutschland

    Andreas Jung

Authors
  1. Ulrich Lehmann
    View author publications

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  2. Andreas Jung
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Corresponding author

Correspondence to Ulrich Lehmann.

Ethics declarations

Interessenkonflikt

U. Lehman hat in den letzten 5 Jahren Vortrags- bzw. Beratungshonorare von Illumina, ThermoFisher und Qiagen erhalten. A. Jung gibt an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Für diesen Beitrag wurden von den Autoren keine Studien an Menschen oder Tieren durchgeführt. Für die aufgeführten Studien gelten die jeweils dort angegebenen ethischen Richtlinien.

Additional information

Schwerpunktherausgeber

H. H. Kreipe, Hannover

W. Weichert, München

Glossar

Alignment

Abbildung erhaltener Sequenzen auf ein Referenzgenom (aktuell für humane Sequenzen: meist hg19), nach wie vor computertechnisch nicht 100 % fehlerfrei gelöst

BAM

„Binary alignment map“, binäres Format zur Speicherung von Sequenzdaten, komprimierte Version eines SAM-Files. SAM-Files sind wie Texte lesbar, BAM-Files nicht

BCL

„Binary base call“, enthält Daten zu jeder einzelnen identifizierten Base, muss in ein FASTQ-File umformatiert werden (sind sehr groß)

BED

„Browser extensible data“, enthält zusätzliche Informationen, z. B. Abschnitte des menschlichen Genoms in einem NGS-Panel (genomischen Koordinaten aller Amplikons)

Chip

Mikrowell-Array, in dem die IonTorrent-Sequenzierung stattfindet

FASTQ

Textbasiertes Format, vereinigt Sequenzinformation und zugehörige Qualitätsparameter

flow cell

Reaktionskammer, in der die Illumina-Sequenzierung stattfindet

vcf

„Variant call format“, enthält eine Liste der identifizierten Varianten mit statistischen Informationen

vus/uv

„Variant of unknown significance, unclassified variant“

Aligned Reads

Anteil der Sequenzen (in %), die korrekt zugeordnet werden konnten, abhängig von der Qualität der Sequenzen

Lesetiefe an der

Häufigkeit, mit der eine gegeben Position sequenziert wurde

Mittlere Lesetiefe

Durchschnittliche Häufigkeit, mit der alle Positionen sequenziert wurden

Phred score

Maß für die Wahrscheinlichkeit, dass die Base an einer gegebenen Position korrekt erkannt wurde. Ein Phred Score von 30 entspricht einer 99,9 %igen Wahrscheinlichkeit für die Richtigkeit der Sequenz.

Read-Ausbeute

Gesamtzahl der erhaltenen Sequenzen, abhängig von der Panelgröße (Zahl der Exons bzw. Gene) und der Zahl der parallel in einem Lauf sequenzierten Proben

Strand bias

Eine Variante findet sich überwiegend nur in einem der beiden DNA-Stränge, sollte i. d. R. nicht größer als 80:20 bzw. kleiner als 20:80 sein

VAF/MAF

„Variant allele frequency, mutant allele frequency“, Anteil der varianten Sequenz (in %) an der Zahl aller Sequenzen für diese Position

Varianten Position

Kann von der mittleren Lesetiefe erheblich abweichen

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Lehmann, U., Jung, A. Next Generation Sequencing in der Pathologie. Pathologe 42, 363–368 (2021). https://doi.org/10.1007/s00292-021-00953-6

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