Die Hemmung des P-Glykoprotein-mediierten, transepithelialen Zytostatikatransportes durch R-Verapamil, Cyclosporin SDZ PSC-833 und Tamoxifen in einem Adenokarzinom-Monolayer-Modell

Zusammenfassung

Grundlagen

Die Multidrug-Resistenz (MDR) gilt als wichtiger Chemoresistenzmechanismus besonders bei hämatologischen, aber auch bei soliden Malignomen. Inhibitoren des MDR-Effektors P-Glycoprotein (P-GP), Chemomodulatoren genannt, zeigten für den Fall solider Tumoren aufgrund nebenwirkungsbedingter Einschränkungen der erreichbaren Konzentrationen bisher noch keine klinischen Erfolge. Mit der Fragestellung, ob und wie weit Chemomodulatoren den P-Gpmediierten Zytostatikatransport in intestinalen Karzinomzellen hemmen, wurden neben dem Antiöstrogen Tamoxifen (TMX) die speziell für die MDR-Reversion entwickelten Chemomodulatoren, nämlich das weniger kardiotoxische R-Enantiomer von Verapamil (R-VPL) und das nichtimmunsuppressive Cyclosporin SDZ PSC-833 (PSC), in vitro getestet.

Methodik

Unter Verwendung von HCT-8 intestinalen Adenokarzinomzell-Monolayem untersuchten wir den P-Gp-mediierten, transmembranen, sekretorischen Transport von Vinblastin, einem P-Gp-Substrat, sowie den zellassoziierten Vinblastingehalt in An- oder Abwesenheit obengenannter Chemomodulatoren unter verschiedenen extrazellulären pH-(pHo-)Bedingungen, wie sie in soliden Tumoren vorkommen. Zusätzlich führten wir durchflußzytometrische Effluxmessungen mit dem P-Gp-Substrat Rhodamin 123 unter denselben extrazellulären Bedingungen durch. Das Ausmaß der durch die Chemomodulatoren bedingten Resistenzreversion wurde anhand von Chemosensitivitätsassays (Inkorporation von³H-Thymidin) mit HCT-8 Einzelzellsuspensionen gezeigt.

Ergebnisse

Die Modulatoren R-VPL, PSC und TMX inhibierten den transepithelialen VIN-Transport in einem Ausmaß von bis zu 50,55 bzw. 30%, der zellassoziierte Vinblastingehalt war nach 5h im Vergleich zur Kontrolle 3,7-, 2,3- bzw. 1.7mal größer. Im Gegensatz zu PSC und TMX stellten wir bei Verwendung von R-VPL einen 32-bzw. 47%igen Verlust der modulierenden Wirkung bei extrazellulärer Ansäuerung (pHo 7,0 bzw. 6,8) fest. Damit übereinstimmende Ergebnisse erzielten wir auch bei den durchflußzytometrischen Studien unter gleichen extrazellulären Bedingungen. Die Chemosensitivitätsassays ergaben einen 8-, 5.3- und 10,7fachen Anstieg der VIN-Toxizität durch R-VPL (10 μM), PSC (100 ng/ml) bzw. TMX (10 μM).

Schlußfolgerungen

Mit TMX konnte trotz schwacher P-Gp-Inhibition eine deutliche Resistenzreversion bewirkt werden, was darauf hindeutet, daß zusätzliche Mechanismen an der Resistenz der Zellinie beteiligt sind, die durch TMX, unabhängig von P-Gp-Interaktionen, beeinflußbar sind. Der festgestellte Wirkungsverlust von R-VPL unter sauren Bedingungen könnte als Erklärung der vorherrschend negativen Ergebnisse klinischer Studien mit Verapamil bei Trägern solider Tumoren dienen. Sofern MDR wesentlich zum fehlenden Ansprechen solider Tumoren auf Chemotherapie beiträgt, würden wir klinische Erfolge mit PSC erwarten, das sich bei geringer klinischer Toxizität durch ein hohes vom pHo weitgehend unabhängiges P-Gp-Inhibitions-potential auszeichnet.

Summary

Background

Multidrug resistance (MDR) is known to be an important mechanism of chemoresistance especially in hematologic and presumably in solid malignoma. Inhibitors of MDR-mediating P-glycoprotein (P-Gp) called chemomodulators. however, did not cause significant reversal of resistance in clinical trials so far. Main problems consisted in achieving sufficient concentrations and adverse side effects of chemomodulators. We tested chemomodulators especially developed for MDR reversal, namely the less cardiotoxic R-enantiomer of verapamil (R-VPL) and the non-immunosuppressive cyclosporine SDZPSC-833 (PSC), and further the antiestrogen tamoxifen (TMX) with respect to the inhibition of P-Gp-mediated transport of cytostatics in polarized intestinal carcinoma cells in vitro.

Methods

Using the HCT-8 intestinal adenocarcinoma cell monolayer model we assessed P-Gp-mediated, transmembrane, secretory transport of vinblastine (³H-VIN), a P-Gp substrate, as well as the cell-associated VIN-content in presence/absence of above chemomodulators under different extracellular pH (pHo) conditions known to prevail in carcinoma. Additionally we performed flow cytometric efflux experiments with the P-Gp substrate rhodamine 123 under same extracellular conditions. Reversion of resistance due to chemomodulators is shown by chemosensitivity assays (incorporation of³H-thymidine) of HCT-8 suspension cells.

Results

Compared to controls R-VPL (10 μM), PSC (100 ng/ml) and TMX (10 μM) inhibited³H-VIN transport up to 50, 55 and 30%, respectively and cell associated drug content was increased about 3.7, 2.3 and 1.7 times, respectively. In contrast to PSC and TMX effect we observed a significant 32 and 47% loss of chemomodulating capacity of R-VPL at pHo 7.0 and 6.8 when compared with the inhibition at pHo 7.5. Corresponding results were gathered from flow cytometry. Chemosensitivity assays showed an 8-, 5.3- and 10.7-fold increase of VIN-cytotoxity due to R-VPL, PSC and TMX, respectively.

Conclusions

TMX displayed high overall resistance reversion, despite of low specific inhibition of P-Gp-mediated fluxes indicating further resistance mechanisms in HCT-8 cells revertable by TMX independent of its interaction with P-Gp. Our results could serve possible explanation for the predominately negative results of clinical studies with verapamil as MDR revertant in patients with resistant solid tumors because of only partial P-Gp inhibition at clinically achievable concentrations and significant loss of efficacy under acidic pHo-conditions. Because of high and pHo-independent capacity of P-Gp-inhibition PSC seems to be the most suitable chemomodulator as far as MDR contributes to the overall unresponsiveness to chemotherapy in solid tumours.